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血球計數板計數誤差的來源及解決方案 ——自動化計數

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20140610 打印 字體:  
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血球計數板一直是實驗室細胞計數的金牌標準。自從18世紀在法國第一次被用于分析病人的血液樣本,血球計數板在過去幾百年中已經得到一系列的重大發展,相比以前計數更為精確、使用更為簡單,并最終形成了今天我們使用的樣子。現在血球計數板計數仍然是所有細胞學研究的一個組成部分,然而其計數存在的問題由于自身固有的設計和使用方法并沒有隨著時間而消失。我們在這里將要列出造成血球計數板計數誤差的來源, 并將討論自動化計數是如何消除這些問題的。


血球計數板計數誤差的來源


1. 人工失誤(混勻、加樣、稀釋、計算錯誤以及人工操作誤差)


a. 在對5個操作者的觀察中,操作錯誤和隨機錯誤分別占3.12%和7.8%[3]


b. James M. Ramsey做了一項實驗,衡量取樣區和稀釋系數如何影響計數的準確性。


他測試了3個取樣區面積(18, 9和4 mm2)及兩個稀釋系數(1:100 和 1:25)。取樣面積減小時CVs值是升高的,稀釋倍數的升高會降低CVs[4]


 c. Bane 發現,當同一個操作者去對同樣的兩份精液樣品計數時,計數結果的差異55%歸因于取樣和移液問題, 45%歸因于計數室和細胞計數問題 [5]。 Freund和Carol 展開的另外一項實驗表明,不同操作者之間的計數差異能高達52%,而同一個操作者的計數差異為20%[5]


2. 多次計數以保證結果準確性的必要性


a. 1907年, John C. DaCosta 聲明,為了得到精確的計數結果,很有必要取血液樣品中的多滴血液分別進行計數[1]。


b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出結論, 為了得到10%, 15%和 20%的血球計數板計數準確性, ,必需的樣品數分別為7份, 3份和2份,每份樣品中分別包含180個, 200個和125個細胞[6]


c. 1881年, Lyon 和Thoma推測血球計數板的標準誤差為 ,其中n即計數的細胞數目。


d. 1907年, William Sealy以“學生”的名義發布了他計數釀啤酒師的酵母的工作,他特地通過實驗和數學模型計算了計數誤差,公式也為[7,8]


3. 細胞均勻分布的要求


a. 1912年, James C. Todd將細胞分布不均勻列為計數誤差的問題來源[1]


b. 學生也說有兩項主要的計數誤差來源,一為吸取的酵母樣品不能夠代表原液的濃度,另一個是隨機取樣時細胞在計數區域分布不均勻[7,8]


c. 1947年, 一篇文章提到血球計數板中的細胞濃度分布不均勻問題。初布的結果顯示,離進樣口的濃度分別比平均濃度低3.5%和高3.5%[9]


4. 儀器及材料差異(柵格,深度,蓋玻片,緩沖液類型以及移液器) 


a. 結果顯示計數室的計數誤差和移液器(CV%)造成的計數誤差分別在大約4.6% 和4.7%[10]


b. 在一項5個計數人員的計數實驗中,移液器和血細胞計數器造成的誤差分別為9.46% 和4.26%[3]


c. 1961年, Sanders和Skerry得出結論,蓋玻片的位置能造成7.6%的計數差異[11]。 


d. 在關于不同稀釋步驟的計數實驗中,隨著稀釋步驟的增加,變異系數升高,每個血細胞計數系統的誤差如下: Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)[12]


解決血球計數板的計數問題


隨著新技術的發展,如計算機技術、自動化軟件、光學鏡片、熒光染料、精密制造,以及現代技術如熒光顯微技術、流式細胞術、圖像細胞術,自動化已經解決了血球計數板存在的許多問題[13-25]


自動化計數解決:


人工操作誤差 - 為了解決這個問題,自動化和機器人技術能夠代替人工的樣品操作和計數操作。


加樣誤差 - 取樣區越多、計數細胞越多,隨機誤差越小,但是需要時間越多。通過應用自動取樣或者成像技術,成千上百萬的細胞能在很短時間內被分析,提高了效率,并把分析中的隨機誤差降到更低。 


移液和稀釋誤差 - 這些取決于操作者的操作經驗。通過采用自動加樣器或者自動液流系統,這個誤差可以被降到更低[26]


材料誤差 - 計數室的誤差是由于不同品牌的血球計數板或者同一品牌不同批次間的差異造成的。這也可以通過自動細胞計數儀(細胞計數儀的選擇,請查閱 http://dakewe.com/product/view/id-71.html 或百度文庫 http://wenku.baidu.com/view/f13faf4916fc700abb68fc54.html  中《細胞計數儀的選擇》一文)增加取樣量及減小隨機誤差來解決。


細胞分布不均勻 – 血球計數板不合適的清洗,或者蓋玻片放置不正確將會產生誤差。這些可以通過不使用計數室的細胞計數儀來消除,比如流式細胞儀。但是細胞樣品中若是存在細胞團,基于液流計數的儀器將很難計數,而使用圖像計數儀,細胞團可以使用圖像分析算法計數聚集的細胞,這樣可以提高細胞計數的準確性。


綜述


血球計數板幾百年來在生物醫學研究中一直都是一個必備的工具,并且經歷了很多的改進形成了今天研究者們使用的樣子,然而它仍然會造成很多不可避免的計數誤差。今天,現代化的自動細胞計數儀的使用已經很大程度上消除了許多出現誤差的來源,提高了細胞計數的準確性和效率。

 

參閱文獻


1. Davis  JD.  THE  HEMOCYTOMETER  AND  ITS  IMPACT  ON  PROGRESSIVE-ERA   MEDICINE.  Urbana:  University  of  Illinois  at  Urbana-Champaign;  1995.


2. Verso  ML.  Some  Nineteenth-Century  Pioneers  of  Haematology.  Medical  History  1971;  15(1):  55-67.


3. Biggs  R,  Macmillan  RL.  The  Errors  of  Some  Haematological  Methods  as  They  Are  Used  in  a  Routine  Laboratory.  Journal  of  Clinical  Pathology  1948;  1:  269-87.


4. Ramsey  JM.  The  Effects  of Size  of  Sampling  Area  and  Dilution  on  Leucocyte   Counts  in  a  Hemocytometer.  The  Ohio  Journal  of  Science  1969;  69(2):  101-4.


5. Freund  M,  Carol  B.  Factors  Affecting  Haemocytometer  Counts  of  Sperm  Concentration  in  Human  Semen.  Journal  of  Reproductive  Fertility  1964;  8:  149-55.


6. Nielsen  LK,  Smyth  GK,  Greenfield  PF.  Hemacytometer  Cell Count Distribution: Implications of  Non-Poisson  Behavior.  Biotechnology  Progress  1991;  7:  560-3.


7. Student.  On  the  Error  of  Counting  with  a  Haemacytometer.  Biometrika  1907;  5(3):  351-60.


8. Shapiro  HM.  "Cellular  Astronomy"  -  A  Foreseeable  Future  in  Cytometry.  Cytometry  Part  A  2004;  60A:  115-24.


9. Hynes  M.  The  Distribution  of  Leucocytes  on  the  Counting  Chamber.  Journal  of  Clinical  Pathology  1947;  1:  25-9.


10. Berkson  J,  Magath  TB,  Hurn  M.  The  Error  of  Estimate  of  the  Blood  Cell  Count  as  Made  with  the  Hemocytometer.  American  Journal  of  Physiology  1940;  128:  309-23.


11. Sanders  C,  Skerry  DW.  The  Distribution  of  Blood  Cells  on  Haemacytometer  Counting  Chambers  with  Special  Reference  to  the  Amended  British  Standards  Specification  748 (1958).  Journal  of  Clinical  Pathology  1961;  14:  298-304.


12. Christensen  P,  Stryhn H,  Hansen  C.  Discrepancies  in  the  Determination  of  Sperm  Concentration  using  Bürker-Türk,  Thoma  and  Makler  Counting  Chambers.  Theriogenology  2005;  63:  992-1003.


13. Al-Rubeai  M,  Welzenbach K,  Lloyd  DR,  Emery  AN.  A  Rapid  Method  for  Evaluation  of  Cell  Number  and  Viability  by  Flow Cytometry.  Cytotechnology  1997;  24:  161-8.


14. Fazal  SS.  A  test  for  a  Generalized  Poisson  Distribution.  Biometrical  Journal  1977;  19(4):  245-51.


15. Hansen  C,  Vermeiden  T,  Vermeiden  JPW,  Simmet  C,  Day  BC,  Feitsma  H.  Comparison  of  FACSCount  AF  system,  improved  neubauer  hemocytometer,  Corning  254  photometer,  SpermVision,  UltiMate  and  NucleoCounter  SP-100  for  determination  of  sperm  concentration  of  boar  semen.  Theriogenology  2006;  66(9):  2188-94.


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